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Probleme mit dem Western - Checkliste fürs Troubleshooting (Teil 1/3 - Probenvorbereitung)

Seit Jahrzehnten nutzen wir Westerns als Methode zum Nachweis von Proteinen. Doch unabhängig davon, wie viele unzählige Westerns man bereits durchgeführt hat oder wie viel Routine und Erfahrung man bereits gesammelt hat, steht jeder irgendwann einmal vor einem Problem mit seinem Western. Ob zu wenig Signal, unspezifische Banden oder zu viel Hintergrund – jeder kennt solche Scherereien. Mit unserer Checkliste versuchen wir, das Auftreten solcher Hindernisse zu verringern. Viel Erfolg und gutes Gelingen!

 vorbereitung western blot proben

 

Wurden die Proben bei der Herstellung gekühlt?
Bei der Verwendung eines Ultra-Turrax (einem rotierenden Messer) oder eines Ultraschalls müssen die Proben unbedingt gekühlt werden (die Probe sollte in Eis stehen), da diese Aufschlussverfahren Wärme produzieren und dadurch zur Degradation der Proteine führen können.

Wie frisch sind meine Proben?
Je frischer die Proben, desto weniger Hintergrund. Diese Regel gilt sowohl für Zellextrakte als auch für Gewebe.
Falls die Proben bereits gelagert wurden, gilt es zu überprüfen, ob die Proteine richtig gelagert wurden.
Proteine können ohne Probleme über Jahre bei –80 °C, aber auch bei –20 °C gelagert werden. Jedoch sollten die Proteinproben stets ohne Ladepuffer und mit Inhibitoren gelagert werden.

Habe ich den richtigen Lysepuffer gewählt?
RIPA-Puffer zählt zu den am häufigsten verwendeten Lysepuffern. Die Proteine werden durch RIPA-Puffer denaturiert, indem die native dreidimensionale Struktur zerstört wird. Aufgrund seines SDS-Gehaltes ist er nicht für Immunprezipitationen (IPs) geeignet.
NP-40- oder Triton-X-Puffer hingegen denaturieren die Proteine im Normalfall nicht. Sie eignen sich daher bei der Isolierung von Membranproteinen oder auch bei Immunprezipitationen.
CHAPS-Puffer denaturieren die Proteine nicht und bewahren dabei die native Proteinstruktur.

Habe ich Stabilisatoren eingesetzt?
Unabhängig davon, welche Lyse verwendet wurde, sollte stets ein Protease-Inhibitor oder besser noch ein Protease-Inhibitor-Cocktail eingesetzt werden.
Falls Phosphorylierung untersucht wird, sollte zusätzlich auch ein Phosphatase-Inhibitor dazugegeben werden.

proteinproben
Bild: Proteinproben

Wieviel Protein habe ich und wieviel lade ich?

Für einen standardisierten, reproduzierbaren Western Blot ist es unerlässlich, die Proteinmenge zu bestimmen. Verschiedene manuelle Verfahren wie BCA , Bradford oder auch Coomassie werden hierfür verwendet.
Nachdem die Proteinmenge bestimmt ist, sollten die Proben auf 20 – 40 µg pro Bahn angepasst werden.
Es empfiehlt sich, anschliessend einen Mix des Proteingemisches mit Ladepuffer für die gewünschte Anzahl Western Blots herzustellen und das Protein ohne Ladepuffer aufzubewahren, da es bei einer Lagerung des Proteins mit Ladepuffer häufig zum Ausfallen des SDS kommt.

B-Mercaptoethanol (BME) oder DTT?
BME ist kostengünstiger als DTT , jedoch verläuft die Reduktion der Disulfidbrücken in einem Gleichgewichtszustand. Dazu kommt die sehr hohe Flüchtigkeit von BME. Dadurch kann es über die Zeit zu einem Rückgang der BME-Konzentration im Puffer kommen und die Sulfidbrücken reformieren sich, was dann zu verschwommenen und unspezifischen Signalen führen kann.
DTT ist stabiler und weniger flüchtig. Die Disulfidbrücken bleiben dauerhaft aufgebrochen. Daher eignet sich DTT sehr gut für die lange Lagerung von Proteinproben oder bei Proteinen mit grosser Anzahl an Disulfidbrücken.

Protein aufkochen oder nicht?
Um eine wirksame Denaturierung des Proteins zu erreichen, wird das Protein in den meisten Fällen vor dem Auftragen auf das Gel für einige Minuten auf 95 °C gekocht . Je nach Proteinstruktur darf man bestimmte Proteine jedoch nicht aufkochen. Proteine mit transmembranen Domänen neigen dazu, beim Aufkochen zu aggregieren. Anschliessend kann es zu Problemen bei der Detektion des Antikörpers kommen.

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