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Probleme mit dem Western - Checkliste fürs Troubleshooting (Teil 2/3 - Gelelektrophorese)

Seit Jahrzehnten nutzen wir Westerns als Methode zum Nachweis von Proteinen. Doch unabhängig davon, wie viele unzählige Westerns man bereits durchgeführt hat oder wie viel Routine und Erfahrung man bereits gesammelt hat, steht jeder irgendwann einmal vor einem Problem mit seinem Western. Ob zu wenig Signal, unspezifische Banden oder zu viel Hintergrund – jeder kennt solche Scherereien. Mit unserer Checkliste versuchen wir, das Auftreten solcher Hindernisse zu verringern. Viel Erfolg und gutes Gelingen!

 vorbereitung western blot proben

 

Habe ich eine saubere Ausrüstung?
Gerade für einen gelungenen Western sollte das Sauberhalten des Equipments an oberster Stelle stehen. Die Glasplatten müssen sehr gründlich gereinigt werden und sollten mit fusselfreien Tüchern getrocknet worden sein. Jegliche Gelreste, auch noch so klein, ergeben später Unebenheiten im Gel, die wiederum zu unsauberen Laufbanden führen. Ebenso sollten die Kämme keine Gelreste oder Bruchstellen vorweisen. Aber auch die Schwämme sollten nach dem Transfer immer sehr gründlich vom Transfer-Puffer befreit werden,da ansonsten Schatten der Gelkassette auf dem Blot sichtbar werden können.

Verwende ich das richtige Gel?
Je grösser das gesuchte Protein, desto kleiner die Prozentzahl des SDS-Gels. Je nach gesuchtem Protein sollte man das Gel anpassen; als kleine Orientierungshilfe: Für die meisten Proteine zwischen 25 – 100 kDa ist ein 10%-Gel zu empfehlen. Proteine ≤ 25 % sollten mit 12 – 15% und Proteine ≥ 100 kDa sollten mit 6 – 8%-Gelen aufgetrennt werden.

Habe ich frisches APS und TEMED genutzt?
Für eine optimale Polymerisation sind APS  und TEMED  unerlässlich. TEMED sollte alle 3 Monate ausgewechselt werden und APS immer frisch zubereitet sein. Am besten präpariert man 50 ml 10%-ige APS-Lösung, filtriert diese durch ein 0.45 µm-Spritzenfilter  und aliquotiert anschliessend 500 µl der Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen , um sie dann bei –20 °C zu lagern. Für jede SDS-Präparation sollte ein neues Röhrchen aufgetaut werden. Da es nur 500 µl-Aliquots sind, ist dies dann in der warmen Hand in einer bis zwei Minuten erledigt.

Habe ich richtig geladen?
Einer der kritischen Punkte für einen schönen Western Blot ist das Laden der Proteinproben. Es ist essentiell, dass exakt die richtige Menge geladen wird. Dabei sollte die Probe langsam im unteren Teil des Slots einfliessen. Zu schnelles Befüllen kann zum Überlaufen der Probe in den Nachbarslot führen und damit zu Kreuzkontamination und unpräzisen Ergebnissen. Zur Vereinfachung der Beladung gibt es spezielle, extra lange und extra schmale Spitzen, die die Proben langsam in den unteren Bereich des Slots bringen.

Habe ich meinem Gel das Lachen verdorben?
Bei einem Western Blot sollte nur der Wissenschaftler lächeln, da er gute Ergebnisse erzielt hat, und nicht das Gel. Ein lachendes Gel (also eine ungerade Laufbande) entsteht, wenn die äusseren Banden langsamer durch das Gel laufen als die Inneren. Mit drei einfachen Tricks lässt sich dieser ungewünschte Effekt vermeiden:

  • Den Blotting Tank komplett mit Transfer-Puffer füllen
  • das Gel während des gesamten Transfers kühlen
  • alle Slots füllen, selbst die, die „ungenutzt“ bleiben.Hierfür einfach den Probenpuffer ohne Protein in der gleichen Menge wie das Proteingemisch auftragen.


Verwende ich die richtige Membran?
Die richtige Membran ist einer der Schlüssel zu einem erfolgreichen Western Blot. Dabei sollte man sich über zwei Faktoren Gedanken machen: Die Membran und ihre Porengrösse. Am häufigsten werden Nitrocellulose-Membranen verwendet, da sie kleine (<20 kDa) bis grosse Proteine detektieren können.
Für sehr grosse Proteine (≥150 kDa) kann es vorteilhaft sein, eine PVDF-Membran zu nutzen. Sie muss zwar zunächst in Methanol aktiviert werden, benötigt jedoch anschliessend nicht zwingend Methanol im Transfer-Puffer. Dies wiederum ist ein grosser Vorteil, da grosse Proteine bei zu viel Methanol in ihrer Umgebung dazu neigen können auszufallen.
PVDF ist zwar die teurere Membran, dafür jedoch auch die sensitivere der beiden. Bei sehr geringen Mengen an Protein kann es sinnvoll sein, PVDF einzusetzen.
Für Fluoreszenz-Westerns sind die Standard-PVDF-Membranen hingegen nicht geeignet, da sie zu viel Autofluoreszenz produzieren. Hier kann man die teuren Spezial-PVDF-Membranen verwenden oder, falls die Proteine geeignet sind, auch eine normale Nitrocellulose-Membran.
Hat man sich für die richtige Membran entschieden, ist die Porengrösse von wesentlicher Wichtigkeit. Je kleiner das Protein, desto kleiner die Porengrösse. Für Proteine ab 20 kDa sind 0.45 µm die richtige Wahl. Bei kleineren Proteinen sollte man 0.2 µm verwenden.

Möchte ich verschieden grosse Proteine auf einem Western Blot nachweisen?
In der Praxis werden häufig zwei unterschiedlich grosse Proteine gleichzeitig transferiert: Das gesuchte Protein und ein Kontrollprotein. Dabei kommt es jedoch in vielen Fällen zu Problemen beim Transfer. Da kleine Proteine wesentlich schneller transferiert werden als grosse, kann es passieren, dass das kleine Proteine durch die Membran hindurch transferiert wurde und im Anschluss nicht detektierbar ist.
Falls genug Probe vorhanden ist, empfiehlt es sich, zwei Gele laufen zu lassen. Das Gel mit dem kleinen Protein wird dann jedoch bereits nach einer Stunde Transfer entnommen und das gesuchte Protein mit höherem Molekulargewicht wird noch weiter transferiert.
Wenn jedoch zwingend beide Proteine auf derselben Membran detektiert werden müssen, kann es hilfreich sein, die Porengrösse zu variieren. Eine Porengrösse von 0.2 µm kann ebenso helfen wie die Verwendung einer Membran mit höherem Bindungspotential, wie eine PVDF-Membran.

Habe ich mein Sandwich richtig belegt?
Der häufigste Fehler der beim Transfer passieren kann, ist das falsche Zusammenlegen des Sandwiches. Nachfolgend eine kleine Erinnerungsauffrischung für diejenigen, die eine solche wünschen.


Bild: Schematischer Aufbau eines Western Blot-Sandwich

Natürlich muss aber auch beim Netzteil und beim Deckel der Transferkammer auf den richtigen Sitz der Elektroden geachtet werden. Ich empfehle hierbei immer, sich an den Farben der Kabel und Stecker zu orientieren, und pflege mein Mantra: „Rot zu rot und schwarz zu schwarz“.

Ist mein Transfer-Puffer optimiert?
Vor allem sehr grosse Proteine transferieren häufig schlecht oder nur partiell. Um aber das gesamte Protein aus dem Gel zu transferieren, kann es hilfreich sein, den Transfer-Puffer zu optimieren, indem man eine kleine Menge SDS (0.1 %) zum Transfer-Puffer gibt und gleichzeitig das Methanol auf 10 % reduziert.

Benötige ich einen Transfer über Nacht?
Gerade bei Proteinen ≤ 100 kDa ist ein Transfer über Nacht empfehlenswert. Ein Übernacht-Transfer sollte aber unbedingt bei 4 °C und mit verringerter Volt-Zahl (50 V) stattfinden, um eine Überhitzung zu vermeiden.

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