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Probleme mit dem Western - Checkliste fürs Troubleshooting (Teil 3/3 - Detektion)

Seit Jahrzehnten nutzen wir Westerns als Methode zum Nachweis von Proteinen. Doch unabhängig davon, wie viele unzählige Westerns man bereits durchgeführt hat oder wie viel Routine und Erfahrung man bereits gesammelt hat, steht jeder irgendwann einmal vor einem Problem mit seinem Western. Ob zu wenig Signal, unspezifische Banden oder zu viel Hintergrund – jeder kennt solche Scherereien. Mit unserer Checkliste versuchen, wir das Auftreten solcher Hindernisse zu verringern. Viel Erfolg und gutes Gelingen!

western blot analyse roentgenfilm protein

 

Wieso habe ich unterschiedliche Expressionen im Kontrollgen?

expressionen

Der Western Blot wurde eventuell nicht gleichmässig mit Antikörper behandelt. Die Menge der Antikörperlösung sollte vergrössert werden. Bei Inkubationen in 50 ml-Röhrchen empfiehlt es sich, ein Minimum von 5 ml Lösung zu verwenden.

Eventuell sind die Proteinmengen nicht exakt angepasst worden. Es sollte stets ein Coomassie  zur Kontrolle der Bradford-Resultate verwendet werden.

Ausserdem sollte sichergestellt werden, dass das Kontrollprotein nicht reguliert ist und dadurch die Variationen in der Expression entstanden sind. Hierfür eignen sich Gesamtprotein-Färbemittel (Coomassie, Ponceau S, ..)

 

Wieso detektiere ich unspezifische Banden?

unspezifische banden

Eine ungenügende Blockierung könnte eine Möglichkeit sein. Es kann helfen, die Blockierungszeit zu erhöhen oder aber einen anderen Blockierpuffer (Milchpulver, Albumin, Fischgelatine etc.) zu testen.

Unzureichendes Waschen kann dafür sorgen, dass unspezifische Interaktionen mit der Membran nicht weggewaschen werden. Um dies zu optimieren, kann die Anzahl der Waschgänge erhöht, die Waschzeit verlängert oder die Tween-20 -Konzentration erhöht werden (z. B. von 0.05 % auf 0.1 %).

Das Problem kann aber auch durch den zweiten Antikörper entstehen. Um zu testen, ob der zweite Antikörper unspezifisch bindet, sollte man den Western entwickeln, ohne mit dem ersten Antikörper zu inkubieren. Falls die unspezifischen Banden auftauchen, sollte der zweite Antikörper optimiert werden. Der Antikörper kann verdünnt (Faktoren wie 1/20.000 ergeben bei vielen Western Blots noch ausreichend Signal) oder die Inkubationszeit verkürzt werden.

Natürlich kann es aber auch notwendig sein, den ersten Antikörper zu optimieren. Gerade polyklonale Antikörper neigen dazu, unspezifische Bindungen einzugehen. Falls möglich sollte ein monoklonaler Antikörper gewählt werden.
Ausserdem sollten Antikörper zu Beginn immer in einer Verdünnungsreihe ausgetestet werden, da bei zu viel Antikörper unspezifische Bindungen auftauchen und bei zu wenig Antikörper Signal verloren geht.

Eine Verdünnungsreihe der Lysate kann sehr hilfreich sein, um die optimale Proteinmenge ausfindig zu machen. Denn zu viel Protein kann die Bindungen übersättigen und gegebenenfalls unspezifische Signale ergeben.

Durch eine Inkubation des ersten Antikörpers mit dem Immunogen-Peptid kann man abklären, ob es sich bei unspezifischen Banden eventuell um Isoformen oder Spaltprodukte handelt.

 

Warum habe ich kein oder fast kein Signal?

kein signal western blot

Um sicherzugehen, dass das gesuchte Protein an den Antikörper gebunden hat, sollte immer auch eine positive Kontrolle mitgeladen werden. Falls die Kontrolle ein starkes Signal zeigt, die Proben jedoch nicht, kann dies an mehreren Faktoren liegen.

Die Proteinmenge kann ein Problem darstellen. Bei einer zu kleinen Menge an Protein kann es passieren, dass ein Antikörper zu wenig Bindungsstellen findet und daher nur ein schwaches oder gar kein Signal ergibt. Bei zu viel Protein kommt es zu intramolekularen Proteinbindungen, dadurch kann der Antikörper nicht binden und es gibt kein Signal.

Je nach Proteingrösse kann bereits beim Transfer ein Verlust des Proteins eingetreten sein. Kleine Proteine (≤ 10 kDa) können durch die Membran transferiert worden sein. Grosse Proteine (≥150 kDa) können im Proteingel zurückgeblieben sein. Bei kleinen Proteinen sollte die Transferdauer reduziert werden. Bei grossen Proteinen benötigt es dagegen eventuell eine längere Transferdauer, die Zugabe von 0.02 % SDS zum Transfer-Puffer und den Verzicht auf Methanol in diesem.

Kein Signal entsteht ausserdem, wenn der erste und zweite Antikörper nicht kompatibel sind. Der sekundäre Antikörper sollte gegen die Wirtsspezies des primären Antikörpers gebildet sein. Bei einem Mouse Anti-GFP-Antikörper verwendet man also einen Goat Anti-Mouse Sekundärantikörper.

Ebenso kann ein zu starkes Blockieren, zu stringentes Waschen oder ein zu stark verdünnter Antikörper zu einem Signalverlust oder einer Signalreduktion führen.

 

Was kann ich gegen zu viel Hintergrund unternehmen?

hintergrundEin starker, über den ganzen Blot gleichmäßig verteilter Hintergrund kann für eine zu hohe Antikörper-Konzentration sprechen. Der Blot ist sozusagen übersättigt. Dadurch verliert man das Signal und bekommt zu viel Hintergrund. Es empfiehlt sich, den Antikörper zu verdünnen.

Das Gleiche kann auch bei der Verwendung von „rohem“ (nicht aufgereinigtem) Antikörperserum geschehen. Hier empfiehlt es sich, die Antikörperlösung aufzureinigen oder die Konzentration zu verdünnen. 

Falls es weisse Flecken auf der Membran zu sehen gibt, kann dies darauf hinweisen, dass die Membran teilweise ausgetrocknet ist. Damit dies nicht geschieht, sollte immer genügend Flüssigkeit genutzt werden. 5 – 10 ml pro Western Blot sind bei Waschschritten und Blockierungen zu verwenden. Falls Antikörper genutzt werden, die sehr sparsam verwendet werden müssen oder in geringer Verdünnung Verwendung finden, kann eine Membran auch mit Flüssigkeit eingeschweißt werden.
Das bietet die Möglichkeit, pro Membran bis auf 1 ml Lösung zu reduzieren. 

Es kann von Vorteil sein, eine Nitrocellulose-Membran zu verwenden, da diese weniger Hintergrund ergibt als PVDF-Membran.

Wenn die Primärantikörper bei zu hoher Temperatur inkubiert werden, können auch diese zu starken Hintergründen beitragen. Daher ist eine Übernacht-Inkubation bei 4 ºC empfehlenswert.

Außerdem sollte die Blockierung optimiert werden. Das Blockiermittel ist eventuell nicht optimal für die Anwendung. Gerade BSA kann einen starken Hintergrund produzieren, wenn es mit IgG kontaminiert ist.

Zusätzlich kann es sinnvoll sein, die Waschschritte zu verlängern und Detergenzien wie Tween 20 in der Waschlösung anzupassen.

Mit steigender Belichtungszeit wird auch der Hintergrund stärker. Dabei wird aber die Detektion nicht sensitiver. Daher sollte stets darauf geachtet werden, den Western Blot nicht überzubelichten.

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