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Das Blockieren optimieren

Wir haben drei Fragen zur Blockierung zusammengestellt, die sich jeder vor seinem Western Blot stellen sollte.


Zu wenig Signal, zu viele verschiedene Signale oder gar kein Signal? Unabhängig davon, welches dieser Probleme bei einem Western Blot auftritt, die unliebsame Konsequenz ist das Optimieren und Verbessern der Methode. Es wird viel Zeit investiert, die Signale zu verbessern, indem verschiedene Antikörperkonzentrationen getestet, die Inkubationszeiten variiert oder die Proteinmenge verändert wird. Häufig wird jedoch eine sehr wichtige Variable vergessen: das Blockieren.
Blockierung eines Western Blots in einem Zentrifugationsröhrchen
Das Blockieren spielt eine wesentliche Rolle bei der Intensität eines Signals und sollte daher ebenso optimiert werden wie die restlichen Parameter. Da die Blockierung häufig mehrfach in der Methode verwendet wird (im Blotten, im 1. und im 2. Antikörper), hat sie einen sehr grossen Effekt auf das Endergebnis und sollte stets ausgetestet werden.

Die drei nachfolgenden Fragen sollen helfen, das Optimieren eines Blockierungsverfahrens zu erleichtern:

1. Welches Blockier-Reagenz sollte ich verwenden?
Milchpulver und Albumin sind die beiden am meisten verwendeten Blockierungen. Aber Achtung! Milch enthält Phosphoproteine (interferiert mit manchen Antigenen) und Avidin (kann manche Detektionsverfahren beeinflussen), während BSA einen starken Hintergrund produzieren kann durch Kontaminationen mit IgG. Fischgelatine enthält endogenes Biotin, das wie Milchpulver mit bestimmten Detektionsverfahren nicht kompatibel ist. Kommerzielle Puffer hingegen werden häufig aus Protein-Fraktionen gewonnen und besitzen den Vorteil, dass meist keine Phosphoproteine oder Biotine enthalten sind. Häufig sind sie spezifischer und benötigen geringere Blockierzeiten.

2. Wie lange blockiere ich?
Die Standardzeit eines normalen Blockierens beträgt eine Stunde. Je nach Antikörper und Blockier-Reagenz können aber auch kürzere oder längere Zeiten nützlich sein. Bei manchen Antikörpern ist ein kürzeres Blockieren sogar wichtig, damit es nicht zu einer Überblockierung kommt und Signal verloren geht. In die Blockierzeit kann je nachdem auch die Antikörper-Inkubation einkalkuliert werden. Falls in der Blockier-Reagenz inkubiert wird und das Signal zu schwach sein sollte, lohnt es sich eventuell, die Blockier-Reagenz bei einer Übernacht-Inkubation zu verdünnen.

3. Möchte ich meine Antikörper recyceln?
Wenn mit limitierten Antikörpern gearbeitet wird, ist es gängige Praxis, diese wiederzuverwenden. In solch einem Fall sollte kein Milchpulver als Blockier-Reagenz verwendet werden, da Milch schnell schlecht wird und ausfällt. Um die Problematik mit dem Einfrieren von Antikörpern zu umgehen, sollte der Antikörper-Blockier-Mix in 50%igem Glycerol im Gefrierschrank bei minus 20 Grad gelagert werden.Eine gute Blockierung reduziert die unspezifischen Bindungen und ergibt bessere Signale

Bei der Optimierung eines Western Blots sollte also unbedingt auf die Blockierung geachtet werden, um den Verbesserungsprozess so effizient wie möglich zu gestalten. Man sollte die Nutzung kommerzieller Puffer in Betracht ziehen, da diese eine hohe Reinheit besitzen und damit keine Kontaminationen auf den Western Blot bringen können. Ausserdem sind spezifische Protokolle bereits evaluiert und reduzieren den persönlichen Aufwand.

 

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